基于單分子熒光成像技術(shù)，利用sCMOS相機(jī)（Gloria 1104）在16 bit HDR模式下，集成倒置熒光顯微鏡，對(duì)甘油-水溶液中單分子熒光小球的雙螺旋布朗運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行實(shí)時(shí)成像與追蹤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sCMOS相機(jī)可在大視野、高信噪比及弱信號(hào)下采集數(shù)據(jù)，有效支撐單分子熒光動(dòng)力學(xué)研究及相關(guān)前沿應(yīng)用。
1 實(shí)驗(yàn)背景
單分子熒光技術(shù)能夠在單分子水平上實(shí)時(shí)揭示生物大分子的動(dòng)態(tài)行為及微觀環(huán)境變化，在生物物理研究中，追蹤如雙螺旋結(jié)構(gòu)等復(fù)雜分子的布朗運(yùn)動(dòng)，對(duì)于理解生命科學(xué)前沿的分子互作機(jī)制具有重要意義。然而，單分子熒光信號(hào)極其微弱，易受背景噪聲干擾，對(duì)成像系統(tǒng)提出嚴(yán)苛要求：
高靈敏度，以捕獲接近光子統(tǒng)計(jì)極限的微弱熒光信號(hào)
低讀出噪聲，以避免淹沒(méi)單分子信號(hào)
大視野與高時(shí)間分辨率，以支持軌跡統(tǒng)計(jì)與動(dòng)力學(xué)分析
高動(dòng)態(tài)范圍，應(yīng)對(duì)局部亮點(diǎn)與暗背景共存的場(chǎng)景
2 實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介
2.1 實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)采用寬場(chǎng)熒光顯微成像方式，對(duì)分散于甘油-水混合溶液中的單分子熒光小球進(jìn)行連續(xù)時(shí)間序列采集，通過(guò)控制溶液黏度與激發(fā)強(qiáng)度，使熒光小球在布朗運(yùn)動(dòng)下，呈現(xiàn)出具有空間結(jié)構(gòu)特征的雙螺旋運(yùn)動(dòng)軌跡。
2.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境
光學(xué)平臺(tái)：采用高精度隔振光學(xué)平臺(tái)以消除環(huán)境干擾。
顯微系統(tǒng)：采用尼康倒置熒光顯微鏡，配備100x物鏡，確保光子收集效率最大化。
激發(fā)光源：532 nm激光作為激發(fā)光源，針對(duì)熒光目標(biāo)進(jìn)行精準(zhǔn)激發(fā)。
實(shí)驗(yàn)對(duì)象：甘油-水溶液中的單分子熒光小球。
圖1
2.3 實(shí)驗(yàn)工況
sCMOS相機(jī)型號(hào)：千眼狼Gloria 1104
讀出模式：HDR
圖像位深：16 bit
采集幀率：10 fps
采集畫幅：2048×512
BIN模式：2×2（用于提升信噪比）
3 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述工況下，千眼狼Gloria 1104 sCMOS相機(jī)獲取了高質(zhì)量的單分子圖像：
結(jié)構(gòu)特征捕捉：在時(shí)間序列圖像中（圖2~5依次為0.1 s-0.7 s-2.2 s-3.5 s捕捉），sCMOS相機(jī)清晰捕捉到單分子的雙螺旋形態(tài)，反映受限布朗運(yùn)動(dòng)與微觀環(huán)境耦合結(jié)果。
高動(dòng)態(tài)表現(xiàn)：HDR模式在保持弱信號(hào)可見性的同時(shí)，有效避免了局部亮點(diǎn)飽和。
信噪比表現(xiàn)：在10 fps采集幀率條件下，sCMOS相機(jī)Gloria 1104讀出噪聲未對(duì)單分子信號(hào)造成明顯干擾，目標(biāo)熒光信號(hào)在暗背景下具有良好的對(duì)比度，為后續(xù)的定量軌跡重構(gòu)與動(dòng)力學(xué)建模提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
大視野表現(xiàn)：Gloria 1104提供2048×2048大視野，支持單次采集圖像記錄中覆蓋更多單分子樣本，提高實(shí)驗(yàn)效率與統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖2-5
4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了sCMOS相機(jī)在單分子熒光成像中的可行性與差異化優(yōu)勢(shì)。Gloria 1104在高增益、HDR模式下，能夠兼顧弱信號(hào)探測(cè)能力與高動(dòng)態(tài)范圍需求，實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子雙螺旋布朗運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定觀測(cè)，成像數(shù)據(jù)滿足后續(xù)軌跡分析與動(dòng)力學(xué)建模要求，該方案可用于單分子熒光動(dòng)力學(xué)相關(guān)研究。
附 sCMOS相機(jī)Gloria 1104與主流EMCCD單分子成像設(shè)備對(duì)比
單分子成像設(shè)備技術(shù)對(duì)比：Revealer Gloria 1104（sCMOS）vs Andor iXon Ultra 888 (EMCCD)
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